Ion-exchange membranes for protein crystallization and protein crystals’ derivatization

Esta tesis doctoral se centra en la aplicación de membranas de intercambio iónico para la cristalización de proteínas y la derivatización de cristales de proteínas. El trabajo experimental se divide en tres partes. La primera parte del trabajo se centra en la comprensión del efecto de la topografía en la nucleación. La softlitografía se utilizó para modificar la topografía superficial de las membranas Nafion® con diseños específicos, evitando así cambios en la química de la superficie que pueden enmascarar el efecto de la topografía en la nucleación. Las membranas impresas se caracterizaron por microscopia de fuerza atómica (AFM), microscopia electrónica de barrido (SEM) y ángulos de contacto, y se analizó la cristalización de tripsina de páncreas bovino. La nucleación y el crecimiento de los cristales se controlaron a lo largo del tiempo mediante el uso de microscopía óptica. Los resultados experimentales se compararon con los cálculos teóricos del ratio de la variación de la energía libre de Gibbs de nucleación heterogénea y homogénea. La segunda parte del trabajo se centró en una soft-derivatización
de cristales de proteínas utilizando membranas de intercambio iónico. Nafion® y Neosepta 01 se seleccionaron entre varias membranas por su capacidad de facilitar la nucleación. La cinética del transporte de iones para Br-, (PtCl2-) 4 y Hg2+ se evaluó para modelar el transporte en la celda de derivatización. La estabilidad de los cristales derivatizados por membranas de intercambio iónico a lo largo del tiempo fue comparada con la estabilidad de los cristales derivatizados por el método convencional de inmersión. Los cristales derivatizados con las membranas de intercambio iónico se analizaron mediante sincrotrón y la estructura de la proteína se resolvió con la técnica de reemplazo isomorfo. La tercera parte del trabajo consistió en la integración del concepto de derivatización con membranas de intercambio iónico en un microdispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS). El microdispositivo se diseñó y construyó mediante las técnicas de fotolitografía y soft-lithography. La unión de la membrana al PDMS se realizó mediante grafting. Se realizaron la modelización del transporte de agua, NaCl y Hg2+ en el microdispositivo,
los experimentos de cristalización donde la sobresaturación se conseguió mediante ósmosis, y la evaluación de la calidad de difracción de los cristales se realizó.