Microfluidic single sperm analysis

Samenvatting Microfluїdische technologie wordt steeds frequenter toegepast voor de analyse en scheiding van spermacellen. Verschillende onderzoeken hebben laten zien dat deze technologie zeer geschikt is voor het sorteren van spermacellen op basis van hun motiliteit. Met de beschreven en gebruikte methoden worden vele spermacellen gelijktijdig gesorteerd, die onderling nog veel van elkaar kunnen verschillen. Naast deze bulk methoden, kan de analyse van individuele spermacellen erg interessant zijn voor sperma selectie bij geassisteerde voortplantingstechnieken en voor de opwerking van sperma ten bate van de kunstmatige inseminatie in de veeteelt. Een interessante manier om individuele spermacellen te onderzoeken in een microfluїdisch systeem, is het uitvoeren van non-invasieve elektrische analyse met behulp van geïntegreerde meetelektroden. Om een cel op individueel niveau uitvoerig te onderzoeken, moet deze op een nauwkeurige plaats gepositioneerd blijven gedurende analyse. Veel middelen zijn beschikbaar om individuele cellen (tijdelijk) te positioneren, gebruik makend van hydrodynamische, elektrische, chemische, optische, akoestische en magnetische methoden (hoofdstuk 2). Elk van deze methoden heeft zijn eigen voor- en nadelen. Aangezien het elektrisch karakteriseren van individuele gevangen spermacellen een van de doelen was van dit project, is er een eisen lijst opgesteld om de meest geschikte methode te bepalen. De gekozen methode moet in staat zijn om de sperma cel te vangen op een stabiele, reversibele en niet invasieve manier. Daarnaast moet de methode geïntegreerd kunnen worden met micro-elektroden voor het uitvoeren van elektrische analyses. Op basis van deze opgestelde eisen is een hydrodynamische methode verkozen als meest geschikt voor het vangen van individuele spermacellen. Elektrische analyse van cellen in microfluїdische systemen is in het algemeen gebaseerd op het meten van veranderingen in de impedantie wanneer een cel tussen twee microelektroden geplaatst wordt (hoofdstuk 3). Deze verandering kan informatie bevatten over de celgrootte, het membraan en/of het cytoplasma. Echter moet er ook rekening gehouden worden met de invloed van de geometrie van het microfluїdische systeem op de gemeten veranderingen in de elektrische impedantie. Bij lage frequenties wordt de impedantie voornamelijk bepaald door de capaciteit van de elektrische dubbellaag, terwijl bij hoge frequenties de parasitaire effecten een grote rol spelen. De beste meetfrequentie wordt bepaald door de geometrie van het systeem in combinatie met de geleidbaarheid van het medium en bevindt zich op een frequentie, waarbij de totale impedantie van het systeem voornamelijk bepaald wordt door de weerstand van het elektrolyt. De invloed van de geometrie op de elektrische impedantie kan eenvoudig bepaald worden door het opstellen van een equivalent netwerk. Twee meettechnieken, die regelmatig gebruikt worden voor de elektrische analyse van individuele cellen in microfluїdische systemen, zijn microfluїdische impedantie cytometrie en spectroscopie. In het geval van microfluїdische impedantie cytometrie, stromen cellen door een microfluїdisch kanaal waarin ten minste één electrode paar aanwezig is voor het meten van veranderingen in impedantie bij ten minste één meetfrequentie. Impedantie cytometrie is toegepast voor het onderscheiden van verschillende cel types in eenzelfde celpopulatie en voor de analyse van de cel vitaliteit, morfologie en differentiatie. In het geval van microfluїdische impedantie spectroscopie wordt typisch een enkele cel gevangen, terwijl de elektrische impedantie wordt gemeten over een breed frequentiebereik. Het ontwerp en vervaardiging van een microfluїdisch systeem voor het hydrodynamisch vangen van individuele spermacellen is beschreven in hoofdstuk 4. In dit systeem zijn individuele spermacellen gevangen in kleine microfluїdische zijkanalen, die twee grotere hoofdkanalen verbinden. Door het aanbrengen van een drukverschil over deze zijkanalen ontstaat een vloeistofstroom door deze kanalen, die in staat is om individuele spermacellen te vangen bij de kanaalingang. Na experimenten met verschillende zijkanaal hoogtes, bleek een hoogte van 1 μm meest geschikt te zijn voor het vangen van individuele spermacellen. Na het invangen zijn de plasma membranen, acrosoom membranen en het type geslachtschromosoom in de individuele cellen onderzocht met behulp van fluorescente aankleuringen. Om de motiliteit van individuele spermacellen te onderzoeken m.b.v. elektrische analyse, is het vangsysteem geïntegreerd met micro-elektroden (hoofdstuk 5). Tijdens het invangen van individuele spermacellen is de impedantie continu en differentieel opgenomen bij een meetfrequentie van 1 MHz. Wanneer een cel tussen de meetelektroden periodiek bewoog, werd een oscillatie waargenomen in het elektrische signaal. Na het registreren van deze data is een Fast Fourier Transformatie uitgevoerd om de frequentiecomponenten in dit signaal te onderzoeken. Deze analyse liet een stabiele frequentie zien in het signaal die sterk gerelateerd was aan de slag frequentie van de staart van de cel, welke bepaald is met een optische methode. De robuustheid van de elektrische detectie methode is getest door de slag frequentie van de cellen te variëren door temperatuursveranderingen en blootstelling aan cafeïne. In beide situaties kon het effect op de slag frequentie elektrische bepaald worden. Naast het uitvoeren van elektrische analyse bij statische condities, kunnen spermacellen ook onderzocht worden onder dynamische condities. Hiervoor is een microfluїdisch platform ontworpen en gefabriceerd om de cellen met behulp van impedantie cytometrie te onderzoeken. Hierbij stromen de spermacellen tussen een paar micro-elektroden, terwijl veranderingen in impedantie worden gemeten (hoofdstuk 6). Deze aanpak is gebruikt om een specifieke morfologische afwijking van spermacellen in kaart te brengen, ofwel de aanwezigheid van een cytoplasmatische druppel op de staart van spermacellen. Allereerst is de impedantie differentieel gemeten bij een meetfrequentie van 1.3 MHz terwijl de spermacellen door een klein microfluїdisch kanaal (20 bij 20 μm) stroomden. De vorm van de impedantie verandering over de tijd verschafte informatie over de oriëntatie van de sperma cel (kop of staart eerst). Wanneer een cytoplasmatische druppel aanwezig was op de staart van de cel, was een extra schouder in het impedantiesignaal aanwezig, wat een vergroting van de oppervlakte onder de curve tot gevolg had. Na normalisatie van deze oppervlakte, is een significant verschil gevonden tussen een populatie cellen met en zonder cytoplasmatische druppel. Met behulp van een ROC curve is het onderscheidingsvermogen van de elektrische detectie methode onderzocht, waarbij een oppervlakte onder de curve van 0.85 is gevonden. Met behulp van elektrische detectie zijn verschillende parameters van spermacellen te onderzoeken. Het sorteren tussen spermacellen met goede eigenschappen en spermacellen met mindere eigenschappen kan grote voordelen opleveren ten opzichte van de huidige sperma opwerkingstechnieken. Om dit te realiseren, is een sorteersysteem ontworpen, dat in staat is om de spermacellen te sorteren door middel van diëlektroforese op basis van de opgenomen veranderingen in impedantie (hoofdstuk 6). Dit sorteersysteem bestaat uit drie verschillende elementen: focussering, impedantie detectie en sortering van spermacellen. Ten eerste zijn de spermacellen gefocusseerd met dielektroforese door 4 electroden. Door het exciteren van de focusseer electroden met een 10 MHz 3 V sinus-signaal werden de langsstromende cellen naar het midden van het kanaal geduwd. Dit resulteerde in een hogere uniformiteit van de cel-locatie en -snelheid. Na het focusseren, is de impedantie van langsstromende cellen gemeten. In een eerste experiment stroomde een mix van 3 μm plastic bolletjes en spermacellen door de chip terwijl de impedantie werd gemeten. Een duidelijk onderscheid kon gemaakt worden tussen plastic bolletjes en spermacellen gebaseerd op de absolute verandering in impedantie, waardoor de bolletjes effectief en selectief gescheiden konden worden. Dit sorteersysteem kan mogelijk gebruikt worden om spermacellen met een ongewenst morfologie uit het semen te verwijderen. Het manipuleren van spermacellen met dielektroforese is tot nu toe nog niet uitvoerig onderzocht. Om er zeker van te zijn dat de spermacellen bestand zijn tegen de opgelegde elektrische velden, is de sperma kwaliteit onderzocht na blootstelling aan elektrische velden in een microfluїdische chip (hoofdstuk 7). De kwaliteit van de cellen is onderzocht door de fluorescente aankleuring van de plasma membranen, de acrosoom membranen en de mitochondriale membranen. Hoogfrequente elektrische velden (10 MHz) hadden geen schadelijke invloed op de spermacellen, alhoewel minieme schade is geobserveerd door het gebruik van een microfluїdische chip. Omvangrijke schade is geobserveerd wanneer de frequentie werd verlaagd tot waarden dicht bij gelijkspanning (10 Hz). Deze bevindingen komen overeen met simulaties die uitgevoerd zijn, waarbij het transmembraan potentiaal berekend is. Deze resultaten duiden op dat dielektroforese veilig is toe te passen voor het sorteren van spermacellen in een microfluїdisch systeem.